Le laboratoire de biotechnologies du Musée

Comment lire le DNA d’un loup à partir d’un poil trouvé sur le terrain : le séquenceur à capillaires, la technique du DNA barcoding et la structure en trois zones physiquement séparées du laboratoire de biologie moléculaire du Musée Efisio Noussan

Le Musée régional des Sciences naturelles Efisio Noussan n’est pas seulement le site d’exposition du château de Saint-Pierre, mais aussi le siège opérationnel de La Salle qui comprend, entre autres, un laboratoire de biologie moléculaire accomplissant un travail à bien des égards invisible mais scientifiquement déterminant : lire le DNA des espèces animales, végétales et fongiques présentes sur le territoire valdotain, les identifier avec précision et contribuer à la connaissance de la biodiversité alpine.

Le laboratoire de biotechnologies du Musée, réalisé à partir de 2013 avec la contribution de la Région autonome Vallée d’Aoste et du projet financé par les fonds FEDER « Unité de Recherche VDNA Barcoding », est spécialisé dans le séquençage du DNA de type Sanger et dans la Fragment Analysis (analyse de fragments) : deux techniques basées sur l’utilisation d’un séquenceur à capillaires qui permettent respectivement de lire la séquence des bases azotées et d’estimer avec précision la taille d’un fragment de DNA déterminé.

Le séquençage Sanger : comment ça fonctionne

La méthode Sanger tire son nom du biochimiste britannique Frederick Sanger, qui l’a développée dans les années 1970 et pour laquelle il a reçu son second prix Nobel de chimie en 1980. Dans sa version moderne et automatisée, utilisée dans le laboratoire du Musée, le processus se divise en plusieurs phases distinctes.

Le DNA extrait de l’échantillon biologique est d’abord amplifié par PCR (Polymerase Chain Reaction), une technique qui multiplie ses copies des millions de fois, même à partir de quantités infinitésimales de matériel. Les fragments amplifiés sont ensuite soumis à la réaction de séquençage, au cours de laquelle des molécules appelées didésoxynulcléotides, marquées chacune par un colorant fluorescent différent selon la base azotée correspondante, interrompent la synthèse du DNA en produisant des fragments de longueur variable.

Ces fragments sont ensuite séparés, sous l’effet d’un champ électrique, à l’intérieur de capillaires très fins remplis de polymère au moyen d’une électrophorèse capillaire : les fragments les plus courts migrent plus rapidement que les plus longs. Au fur et à mesure qu’ils passent devant un détecteur laser, les colorants fluorescents émettent des signaux que le logiciel traduit en un électrophorégramme, une séquence de pics colorés qui correspond à la séquence de bases du DNA analysé.

DNA barcoding : identifier une espèce à partir de son DNA

Le DNA barcoding (code-barres DNA) exploite la technique de séquençage pour identifier des espèces biologiques à partir de traces. L’idée, proposée en 2003 par le biologiste canadien Paul Hebert, repose sur un principe simple : tout comme un code-barres identifie un produit dans les rayons d’un supermarché, une courte séquence standardisée de DNA, correspondant à une portion de génome différente d’une espèce à l’autre mais identique entre les individus d’une même espèce, permet d’identifier un organisme même lorsqu’il est impossible de le faire par observation visuelle.

Pour les animaux, le « barcode » le plus utilisé est une portion du gène mitochondrial COI (Cytochrome c Oxidase I). Pour les plantes, on utilise généralement les régions rbcL et matK du chloroplaste. Pour les champignons, la région ITS de l’RNA ribosomique.

Appliqué à la faune de la Vallée d’Aoste, le DNA barcoding permet de surveiller une espèce animale de manière non invasive, sans capturer l’animal, sans perturber la population et sans même le voir. Il suffit en effet d’un poil trouvé sur un grillage, d’une plume ramassée sur un sentier, d’une crotte ou d’un fragment de tissu pour pouvoir l’identifier.

La structure du laboratoire : trois zones physiquement séparées

La qualité des résultats produits par le laboratoire de biotechnologies dépend de manière déterminante de son organisation. Le laboratoire est structuré en trois zones physiquement séparées, définies en fonction du risque de contamination par le DNA.

La NO DNA AREA est la zone la plus contrôlée, dans laquelle sont préparées les solutions et les mélanges de réaction pour la PCR et le Cycle Sequencing. Dans cette zone se trouvent la hotte PCR avec lampes UV pour décontaminer la surface de travail, les balances technique et analytique, l’autoclave et l’étuve thermostatique. Aucun extrait de DNA ne doit pénétrer dans cette zone car de minimes traces pourraient entraîner des contaminations lors des phases d’amplification ultérieures.

La LOW DNA AREA est la zone de réception, de préparation des échantillons et d’extraction du DNA. Ici, les échantillons biologiques sont enregistrés, photographiés et, si nécessaire, observés au microscope : le laboratoire dispose d’un microscope optique à transmission et d’un stéréomicroscope, tous deux reliés à une caméra numérique. Le DNA est extrait à l’aide de procédures impliquant l’utilisation de centrifugeuses, d’agitateurs et de thermomixeurs. Une hotte biologique à flux laminaire stérile est également présente pour l’extraction du DNA à partir d’échantillons nécessitant des conditions de travail particulièrement contrôlées, comme le DNA environnemental.

La HIGH DNA AREA est la zone dans laquelle le DNA amplifié est analysé. C’est ici que se trouvent le thermocycleur pour la PCR, le poste d’électrophorèse du DNA et le séquenceur à capillaires pour le séquençage Sanger et la Fragment Analysis. Une hotte chimique est également présente pour la manipulation de réactifs toxiques ou dangereux.

La séparation physique entre les trois zones n’est pas une mesure de précaution accessoire. La PCR est une technique tellement sensible qu’elle amplifie des traces infinitésimales de DNA, y compris le DNA des opérateurs du laboratoire eux-mêmes, si les précautions nécessaires ne sont pas prises. Maintenir les phases de préparation rigoureusement séparées des phases d’amplification est la condition essentielle qui permet de produire des résultats scientifiquement fiables.

Les applications : de la faune à la traçabilité agroalimentaire

Les activités du laboratoire de biotechnologies du Musée vont de la recherche naturaliste à la valorisation des productions locales. Sur le plan naturaliste, le laboratoire mène des projets de suivi génétique non invasif des espèces animales présentes sur le territoire valdotain, notamment le loup, et a contribué à l’étude de la biodiversité de la faune et de la végétation sauvage alpine grâce à des techniques de DNA fingerprinting. Sur le plan agroalimentaire, il a développé des protocoles de caractérisation génétique des matières premières valdotaines et de traçabilité des produits tout au long de la chaîne de production.

Le laboratoire est en outre ouvert à l’accueil d’étudiants universitaires pour des stages et des thèses expérimentales, sous réserve de la signature d’une convention entre l’université et l’organisme d’accueil, et propose des parcours pédagogiques pour les établissements d’enseignement secondaire sur des thématiques liées aux biotechnologies.