Il laboratorio di biotecnologie del Museo

Come si legge il DNA di un lupo partendo da un pelo trovato sul territorio: il sequenziatore a capillari, la tecnica del DNA barcoding e la struttura in tre aree fisicamente separate del laboratorio di biologia molecolare del Museo Efisio Noussan

Il Museo regionale di Scienze naturali Efisio Noussan non è solo la sede espositiva del castello di Saint-Pierre, ma è anche la sede operativa di La Salle che comprende, tra gli altri, un un laboratorio di biologia molecolare che svolge un lavoro per molti versi invisibile ma scientificamente determinante: leggere il DNA delle specie animali, vegetali e fungine presenti sul territorio valdostano, identificarle con precisione e contribuire alla conoscenza della biodiversità alpina.

Il laboratorio di biotecnologie del Museo, realizzato a partire dal 2013 con il contributo della Regione autonoma Valle d’Aosta e del progetto finanziato con fondi FESR “Unità di Ricerca VDNA Barcoding”, è specializzato nel sequenziamento del DNA di tipo Sanger e nella Fragment Analysis: due tecniche basate sull’impiego di un sequenziatore a capillari che permettono rispettivamente di leggere la sequenza delle basi azotate e di stimare con precisione la dimensione di un determinato frammento di DNA.

Il sequenziamento Sanger: come funziona

Il metodo Sanger prende il nome dal biochimico britannico Frederick Sanger, che lo sviluppò negli anni Settanta e per il quale ricevette il secondo Premio Nobel per la chimica nel 1980. Nella sua versione moderna e automatizzata, quella impiegata nel laboratorio del Museo, il processo si articola in alcune fasi distinte.

Il DNA estratto dal campione biologico è prima amplificato attraverso la PCR (Polymerase Chain Reaction), una tecnica che ne moltiplica le copie milioni di volte partendo anche da quantità infinitesimali di materiale. I frammenti amplificati vengono poi sottoposti alla reazione di sequenziamento, in cui molecole chiamate dideossinucleotidi, marcate ciascuna con un colorante fluorescente diverso a seconda della base azotata corrispondente, terminano la sintesi del DNA producendo frammenti di lunghezza variabile.

Questi frammenti sono poi separati, sotto l’effetto di un campo elettrico, all’interno di capillari sottilissimi riempiti di polimero attraverso elettroforesi capillare: i frammenti più corti migrano più velocemente di quelli più lunghi. Man mano che passano davanti a un rilevatore laser, i coloranti fluorescenti emettono segnali che il software traduce in un elettroferogramma, una sequenza di picchi colorati che corrisponde alla sequenza di basi del DNA analizzato.

DNA barcoding: identificare una specie dal suo DNA

Il DNA barcoding sfrutta la tecnica di sequenziamento per identificare specie biologiche partendo da tracce. L’idea, proposta nel 2003 dal biologo canadese Paul Hebert, si basa su un principio semplice: come un codice a barre identifica un prodotto sullo scaffale di un supermercato, una breve sequenza standardizzata di DNAcorrispondente a una porzione di genoma differente tra specie diverse ma identica tra individui della stessa specie, permette di identificare un organismo anche quando non è possibile farlo attraverso l’osservazione visiva.

Per gli animali, il “barcode” più utilizzato è una porzione del gene mitocondriale COI (Cytochrome c Oxidase I). Per le piante si utilizzano generalmente le regioni rbcL e matK del cloroplasto. Per i funghi, la regione ITS dell’RNA ribosomiale.

Applicato alla fauna della Valle d’Aosta, il DNA barcoding permette di monitorare una specie animale in modo non invasivo senza catturare l’animale, senza disturbare la popolazione, senza nemmeno vederlo. Basta infatti un pelo trovato su un reticolato, una piuma raccolta sul sentiero, una fatta, un frammento di tessuto per poterlo identificare.

La struttura del laboratorio: tre aree fisicamente separate

La qualità dei risultati prodotti dal laboratorio di biotecnologie dipende in misura determinante dalla sua organizzazione. Il laboratorio è strutturato in tre aree fisicamente separate, definite in base al rischio di contaminazione da DNA.

La NO DNA AREA è la zona più controllata, in cui si preparano le soluzioni e le miscele di reazione per la PCR e il Cycle Sequencing. In questa area sono presenti la cappa PCR con lampade a UV per decontaminare la superficie di lavoro, le bilance tecnica e analitica, l’autoclave e la stufa termostata. Nessun estratto di DNA deve entrare in questa zona poiché anche minime tracce potrebbero causare contaminazioni nelle fasi di amplificazione successive.

La LOW DNA AREA è la zona di accettazione, preparazione dei campioni ed estrazione del DNA. Qui i campioni biologici vengono registrati, fotografati e, se necessario, osservati al microscopio: il laboratorio dispone di un microscopio ottico a trasmissione e di uno stereomicroscopio, entrambi collegati a una camera digitale. Il DNA viene estratto attraverso procedure che prevedono l’uso di centrifughe, agitatori e termomixer. È presente anche una cappa biologica a flusso laminare sterile per l’estrazione del DNA da campioni che richiedono condizioni di lavoro particolarmente controllate, come il DNA ambientale.

La HIGH DNA AREA è la zona in cui è analizzato il DNA amplificato. Qui si trovano il termociclatore per la PCR, la postazione per l’elettroforesi del DNA e il sequenziatore a capillari per il sequenziamento Sanger e la Fragment Analysis. È presente anche una cappa chimica per la manipolazione di reagenti tossici o nocivi.

La separazione fisica tra le tre aree non è una misura precauzionale accessoria. La PCR è una tecnica così sensibile da amplificare anche tracce infinitesimali di DNA , compreso il DNA degli operatori del laboratorio stesso, se non si seguono le dovute precauzioni. Mantenere le fasi di preparazione rigorosamente separate da quelle di amplificazione è la condizione che rende possibile produrre risultati scientificamente affidabili.

Le applicazioni: dalla fauna alla tracciabilità agroalimentare

Le attività del laboratorio di biotecnologie del Museo spaziano dalla ricerca naturalistica alla valorizzazione delle produzioni locali. Sul versante naturalistico, il laboratorio porta avanti progetti di monitoraggio genetico non invasivo di specie animali presenti sul territorio valdostano, tra cui il lupo, e ha contribuito allo studio della biodiversità della faunae della vegetazione spontanea alpina attraverso tecniche di DNA fingerprinting. Sul versante agroalimentare, ha sviluppato protocolli di caratterizzazione genetica delle materie prime valdostane e di tracciabilità dei prodotti lungo la filiera di produzione.

Il laboratorio è inoltre aperto all’accoglienza di studenti universitari per stage e tesi sperimentali, previa convenzione tra l’università e l’ente ospitante, e propone percorsi formativi per le scuole secondarie di secondo grado su tematiche legate alle biotecnologie.